临床医学检验技师考试专业真题
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真菌荧光染色在临床诊断的应用优势
一、目前真菌感染现状
真菌广泛存在于自然界，而致病性真菌约有余种。随着器官移植的大量开展及免疫抑制剂、肿瘤患者化疗药物、糖皮质类固醇激素的广泛使用，人类免疫缺陷病*感染的高流行趋势、体内有创检查的大量开展，人口老龄化和糖尿病等慢性疾病患者的增多以及大量应用肾上腺皮质激素的病人，其炎症反应多受抑制，也容易感染真菌；另外导管插管、放疗等应用引起局部组织损伤，为真菌的入侵提供了条件。真菌发病率和死亡率逐年增加，对人类健康的危害日趋严重。因此，真菌感染已经成为一个日益严峻的问题。
二、真菌感染诊断
由于临床对很多真菌感染的微生物特性了解较少，加之真菌感染的临床表现多种多样，通常会出现误诊、漏诊，导致病情加重甚至危及生命。这就需要临床有一个确实有效快速的早期诊断方法。
三、真菌感染分类
1、浅部真菌感染：主要感染机体皮肤，寄生和腐生于表皮，毛发和指甲板的角质组织中，引起浅部真菌病，简称癣病。临床多见的浅部真菌病有：体癣、股癣、手癣和足癣。
2、深部真菌感染：指感染表皮以外组织和器官的病原菌和条件致病真菌，常见的有：念珠菌，隐球菌，组织胞浆菌，马尔尼菲青霉菌，曲霉，毛霉菌，孢子菌丝等。严重的可引起死亡，临床上危害很大。
四、浅部真菌感染五、深部真菌感染－侵袭性真菌病
深部真菌病：深部真菌病是指致病性真菌侵犯皮下组织、黏膜和内脏，感染器官所引起的全身性感染性疾病，其中以白色念珠菌为主。
致病特点：慢性肉芽肿样炎症、溃疡及坏死。
深部感染致病真菌较常见的有念珠菌、曲霉、隐球菌、组织胞浆菌、肺孢子菌、毛霉、马尔尼菲青霉及镰刀菌病。念珠菌属对皮肤、黏膜、指趾甲及内脏均可侵犯。
导致条件性真菌感染增高的因素：HIV、肿瘤化疗、干细胞或器官移植、抗生素使用等。
念珠菌：死亡率第一位，院内血源感染第四位。
曲霉：死亡率高达60%-90%，第二位最常见深部真菌病。
目前临床常用真菌诊断方法对比
传统真菌镜检与真菌荧光染色对比表
一种快速检测真菌的试剂，检测范围广，阳性率高，远优于传统湿片法，临床上毛囊炎糠秕孢子，马拉色菌的检测湿片法基本无效，而荧光法可敏感快速的检测出来，医保收费，需使用荧光显微镜。
内容
传统真菌镜检
真菌荧光染色
真菌荧光染色的临床优势
操作环节
取样→滴加一定浓度的KOH溶液→经酒精灯加热固定→光学显微镜观察
取样→滴加荧光染色液→加盖盖玻片→荧光显微镜观察
操作同样简洁，需要时间短，适用于临床大样本，快速检测。
检测结果
找到真菌菌丝或者孢子结构，得出结果
根据看到荧光标记的真菌菌丝或者孢子结构，得出结果
可以明确明辨糠皮孢子感染、马拉色菌感染(检查糠皮孢子的派克墨水法敏感度更高，不用加热环节，有利于临床实际应用)。
浮载液
10%~20%的KOH或者复方氢氧化钾溶液配方
KOH（氢氧化钾）溶解杂质细胞，荧光剂：与真菌细胞壁中成分发生非特异性的结合
1、检测灵敏度很高，减少检查结果假阴性的发生，进而降低漏检漏检率，提高了皮屑真菌检测的准确率；2、视野清，反应为荧光反应，因此其结果在显微镜视野中以清晰的荧光表现，更易于观察；3、抗干扰强，检测原理是染色液与真菌细胞壁中几丁质等多糖成分反应，因此可排出检测中的其他干扰。
检测器材
光学显微镜
荧光显微镜
荧光显微镜：产生匹配染色液中荧光染色剂的激发光，所需的激发光为紫外光，并在目镜下观察。
辅助材料
载玻片，盖玻片，滤纸
载玻片，盖玻片，滤纸
与传统镜检方式用材一样。
六、荧光染色法原理
荧光染色法是一种利用重组几丁质酶来检测人体各种标本中是否存在真菌有形成分的方法。真菌荧光染色液中，经过特殊荧光素标联的重组几丁质酶可以高亲和力与真菌细胞壁上的几丁质结合并发出荧光，在荧光显微镜下可以清楚的观察到真菌形态。
七、荧光染色操作步骤八、取材方法
1、皮屑：75%乙醇消*患者皮损部位，使用钝头刀从皮损的边缘向外刮取。如果鳞屑量较少，可使用透明胶带法取材。
2、甲屑：75%乙醇消*病甲，从甲变色、萎缩或变脆的部位，健甲与病甲交界处取材，保证一定深度。对伴有甲沟炎患者取材，应采用棉拭子，75%乙醇局部消*后，沾取损害分泌物。
3、毛发：75%乙醇局部消*，选择无光泽毛发或毛囊口折断的毛发，用镊子将毛发从头皮处拔除，尽量保留毛根部。
4、黏膜：口腔黏膜可用钝刀刮片或拭子取材，阴道黏膜可用拭子取材，一般不用浸湿。
5、痰液:痰液标本取自病人清晨漱口后的第一口晨痰，标本存入无菌痰液容器中保存。
6、尿液:尿液标本取自病人的早上的第一次清洁尿，使用无菌容器收集保存，离心后取沉渣作镜检。
7、胸水其他体液：胸水及其他体液标本需要无菌采集于无菌试管中，离心后取沉渣作镜检。
8、白带：白带标本取自病人阴道分泌物，标本存入无菌容器中保存，涂片镜检。
菌真菌荧光染色和KOH染色效
真菌荧光染色和KOH染色效果对比图
（白光光源）：病发内外可见孢子、菌丝
（紫外光光源）：与白光光源同一视野，病发内外可见孢子、菌丝发出亮蓝色荧光
真菌荧光染色的优势总结：
1、高特异性、高效率、高灵敏度
2、提高真菌阳性率，避免假阳性
3、明显缩短真菌镜检时间
4、精准判断“真阳性”，确认“真阴性”
5、各种真菌的菌丝和孢子呈荧光亮色
6、操作简单，速度快，容易观察，
7、孢子少时也不易漏诊，菌丝结构清晰，便于分类。
8、快速查毛囊虫
8、有助于研究真菌学形态
9、利于患者教育和提高依从性
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